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En 1743, Anne-Louise-Marie, la dernière survivante de de la famille des Médicis s'éteint. Son testament prévoit que « les oeuvres d'art lui appartenant devront être conservées, toutes et toujours, dans la ville de Florence ». C'est grâce à ce testament que le musée conserve et expose l'un des patrimoines artistiques les plus anciens et les plus célèbres au monde. Il rassemble la collection existante la plus remarquable de Raphaël et de Botticelli ainsi que des oeuvres majeures de Giotto, Titien, Pontormo, Bronzino, Andrea del Sarto, Le Caravage, Vinci...

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